將熒光基團(tuán)加入到PCR反應(yīng)體系中，通過(guò)不斷累積熒光信號(hào)從而使對(duì)PCR全程的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)實(shí)現(xiàn)，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量分析未知模板的方法，即是熒光定量PCR技術(shù)。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR中，實(shí)時(shí)檢測(cè)全程PCR擴(kuò)增過(guò)程，按照反應(yīng)時(shí)間和熒光信號(hào)的變化能夠?qū)⒁粭l曲線繪制成。
1.熒光背景信號(hào)階段
在該階段，不能區(qū)分背景和擴(kuò)增的熒光信號(hào)，不能對(duì)產(chǎn)物量的變化進(jìn)行判斷。
2.熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段
PCR產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值和起始模板量的線性關(guān)系僅僅在熒光累積進(jìn)入指數(shù)階段才存在，因此，在PCR反應(yīng)在指數(shù)階段來(lái)對(duì)PCR產(chǎn)物的量進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)此將模板Z初的含量推斷出從而進(jìn)行定量分析。由研究可知，每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越少，則Ct值越大。由已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品能夠?qū)?biāo)準(zhǔn)曲線獲得，僅需將未知樣品的Ct值得到，就能夠根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線將該樣品的起始拷貝數(shù)計(jì)算出來(lái)。
3.平臺(tái)期
在平臺(tái)期，擴(kuò)增產(chǎn)物指數(shù)級(jí)的增加不再存在，因此反應(yīng)終產(chǎn)物量與起始模板量之間也不存在。起始DNA拷貝數(shù)也不能夠根據(jù)反應(yīng)終產(chǎn)物計(jì)算出來(lái)。
檢測(cè)方法
1.TaqMan探針?lè)?/div>
當(dāng)探針完整時(shí)，淬滅基團(tuán)吸收?qǐng)?bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)。PCR擴(kuò)增時(shí)，探針在Taq酶的5’-3’外切酶活性作用下酶切降解，分離開(kāi)了淬滅熒光基團(tuán)和熒光基團(tuán)，從而使熒光信號(hào)能夠被熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)接收到。也就是每有一條DNA鏈擴(kuò)增，就會(huì)形成一個(gè)熒光分子，使PCR產(chǎn)物的形成與熒光信號(hào)的累積的*同步實(shí)現(xiàn)。
2.SYBRGreenⅠ法
在PCR反應(yīng)體系中，將過(guò)量SYBR熒光染料加入，SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，將熒光信號(hào)發(fā)射出來(lái)，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)有任何熒光信號(hào)發(fā)射出來(lái)，從而使PCR產(chǎn)物的增加和熒光信號(hào)的增加得到保證。
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